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titulo: Regulação hormonal do pH e do cálcio citosólico em células epiteliais colônicas: Papel de angiotensina II, arginina vasopressina e peptídeo atrial natriurético

linha: Regulação hormonal do pH intracelular

projeto: Efeito da Angiotensina II na regulação do pH intracelular de células T84 (derivadas do intestino), em cultura

area: Fisiologia Renal e da Digestão (Digestória)

biblioteca: Biblioteca do ICB-USP
volumes: 1
num_paginas: 182
idioma: Português
palavras_chave: trocador Na+/H+; células T84; pHi; [Ca2+]i; ANG II; AVP

resumo: VIAS DE SINALIZAÇÃO INTRACELULAR ENVOLVIDAS NO EFEITO BIFÁSICO DA ANG II SOBRE O TROCADOR NA+/H+ EM CÉLULAS EPITELIAIS COLÔNICAS; INTERAÇÃO DA ANG II COM ANP NESSE PROCESSO - O efeito da ANG II na regulação do pHi e [Ca2+]i foi investigado em células T84 (provenientes de carcinoma colônico humano), por meio das sondas intracelulares fluorescentes BCECF-AM e Fluo 4-AM, respectivamente. A velocidade de recuperação do pHi foi calculada por regressão linear dos valores de pHi encontrados nos dois primeiros minutos, após carga ácida por NH4Cl. Os experimentos foram feitos em meio livre de HCO-3/CO2, condição experimental em que o trocador Na+/H+ é o único mecanismo envolvido na recuperação do pHi. Na situação controle, a velocidade de recuperação do pHi foi 0.120 ± 0.001 (n=101) unidades de pH/min e a [Ca2+]i foi 97 ± 3 (n = 100) mM. ANG II (10-12 M) aumentou a velocidade de recuperação do pHi de 106% do valor controle [este efeito foi reduzido por Estaurosporina (inibidor da PKC) ou W13 (antagonista do complexo cálcio-calmodulina), mas não foi alterado com Econazole (inibidor da metabolização do ácido araquidônico pela epoxigenase citocromo P450)] e a [Ca2+]i de 40 % [valor não alterado por Estaurosporina, W13 ou Econazole]. ANG II (10-9 M) aumentou a velocidade de recuperação do pHi de 32% do valor controle [efeito abolido por Estaurosporina e aumentado por W13 mas não alterado por Econazole] e a [Ca2+]i de 97% [valor não alterado por Estaurosporina ou W13 mas reduzido por Econazole]. ANG II
(10-7 M) diminuiu a velocidade de recuperação do pHi para 72% do valor controle [efeito não foi alterado por Estaurosporina mas revertido por W13 ou Econazole] e aumentou a [Ca2+]i de 150 % [valor não afetado por Estaurosporina ou W13 mas reduzido por Econazole]. O efeito bifásico da ANG II foi abolido por Losartan [(10-6 M) inibidor de receptores AT1)], mas não foi alterado por H89 (inibidor da PKA). Os dados indicam que nas células T84 o efeito bifásico, dose dependente, da ANG II sobre o trocador Na+/H+ é feito através receptores AT1, é independente da via de sinalização da PKA, sendo resultante de: 1) estimulação do trocador pela via da PKC (com ANG II 10-12 – 10-7 M) e por aumentos da [Ca2+]i em baixos níveis (com ANG II 10-12 M) e 2) inibição do trocador a altos níveis da [Ca2+]i (com ANG II 10-9 – 10-7 M) por meio da via de produção do ácido araquidônico e/ou seus metabólitos. Solução extracelular livre de Ca2+ (+ EDTA) [(5 x 10-3 M), quelante de cálcio extracelular] diminui a [Ca2+]i e a velocidade de recuperação do pHi (para 37% e 66% do valor controle, respectivamente), mas não altera os efeitos da ANG II (10-12 M, 10-9 M ou 10-7 M) sobre esses parâmetros. Tapsigargina [(10-5 M), inibidor da Ca2+-ATPase do retículo endoplasmático] sozinha ou com ANG II (10-12 M, 10-9 M ou 10-7 M) aumenta a [Ca2+]i para aproximadamente 270% acima do valor controle e diminui a velocidade de recuperação do pHi de aproximadamente 54% do valor controle.
Esses dados sugerem que, nas células T84, o aumento da [Ca2+]i induzida por ANG II é dependente dos estoques de cálcio intracelular. ANP (10-6 M) ou
dimethyl-BAPTA/AM (50 uM, quelante de cálcio intracelular) diminuem a [Ca2+]i respectivamente para 51% e 57% do valor controle e não alteram a recuperação do pHi, mas bloqueiam os efeitos da ANG II (10-12 M, 10-9 M ou 10-7 M) sobre a [Ca2+]i e sobre a velocidade de recuperação do pHi. 

Em conjunto, os dados são compatíveis com a demonstração de dois sítios para o complexo Ca2+-calmodulina no terminal carboxílico da isoforma NHE-1 do trocador Na+/H+. Um sítio de alta afinidade, tonicamente inibitório, que na situação de pequeno aumento do cálcio citosólico liga-se ao complexo cálcio-calmodulina, suprimindo a inibição, ou seja, estimulando o trocador. Outro sítio de baixa afinidade, estimulador do trocador, que liga-se ao complexo cálcio-calmodulina somente quando o cálcio citosólico está em altas concentrações; nestas condições inibe o trocador. De acordo com nossos dados, a estimulação aconteceria na presença de ANG II (10-12 M) ou AVP (10-10 M), sendo que a inibição ocorreria na presença de ANG II (10-9 ou 10-7 M) ou AVP (10-6 M). A interação do ANP com ANG II ou AVP que observamos nas células T84, pode representar relevante regulação fisiológica em condições de depleção ou expansão de volume extracelular no animal intacto.

orientadores: Profa. Dra. Margarida de Mello-Aires

financiadores: FAPESP (Bolsa de Doutorado - durante 48 meses)

vinculo_empregaticio: Bolsista
tipo_instituicao: Instituição de Ensino e Pesquisa
espectativa_atuacao: Pesquisa
area_titulacao: sim

banca: 

COMISSÃO JULGADORA DA TESE DE DOUTORADO DO(A) CANDIDATO(A)

RAIF MUSA AZIZ

JUNTO AO PROGRAMA DE FISIOLOGIA HUMANA DO INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOMÉDICAS DA UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

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Titulo da Tese: "Regulação hormonal do pH e do cálcio citosólico em células epiteliais colônicas: Papel de angiotensina II, arginina vasopressina e peptídeo atrial natriurético”.

Titulares:

1.) Dra. CLAUDIA MARIA DE BARROS HELOU

Doutor e Livre-Docência pela FM/USP, Pesquisadora do Laboratório de Pesquisas Básicas da Unidade de Doenças Renais da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo.

2.) Dr. ANTONIO JOSÉ BARROS MAGALDI

Doutor pela FM/USP, Professor Colaborador do Departamento de Clínica Médica da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo.

3.) Profa. Dra. MARIA TEREZA NUNES

Professor Associado do Departamento de Fisiologia e Biofísica do Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo.

4.) Prof. Dr. FRANCISCO LACAZ DE MORAES VIEIRA

Professor Titular do Departamento de Fisiologia e Biofísica do Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo.

5.) Orientador(a): Profa. Dra. MARGARIDA DE MELLO AIRES

Professor Titular do Departamento de Fisiologia e Biofísica do Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo.

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Aprovada pela Comissão de Pós-Graduação do ICB/USP,

em reunião realizada a 12 de maio de 2004.

Prof. Dr. José Cipolla Neto
Presidente